Article originalDéveloppement d’un endomicroscope non linéaire pour l’observation in vivo in situ de la matrice extracellulaire des tissus pulmonairesDevelopment of a non-linear endomicroscope for the in vivo in situ observation of lung tissue extracellular matrix
Introduction
En permettant l’exploration non invasive de la muqueuse des organes creux, l’endoscopie diagnostique en lumière blanche s’est imposée comme une modalité majeure d’imagerie diagnostique. Elle est cependant limitée par deux facteurs : sa résolution spatiale qui ne donne pas accès à l’échelle microscopique et son caractère superficiel qui ne lui permet pas d’explorer la profondeur de la muqueuse. En transférant les techniques de microscopie confocale de laboratoire au monde de l’endoscopie, la microscopie confocale fibrée de fluorescence, ou endomicroscopie, a repoussé ces limites. Cette modalité émergente d’imagerie médicale permet de visualiser un tissu, in vivo, in situ, avec une résolution microscopique, à différents niveaux de profondeur. Elle offre donc la potentialité d’effectuer un examen histopathologique non invasif en temps réel lors d’une endoscopie. Jusqu’à présent, la technique exploite la fluorescence de composants exogènes ou endogènes (autofluorescence) par excitation monophotonique.
Actuellement, l’endomicroscopie d’autofluorescence monophotonique permet l’exploration du système respiratoire lors d’une bronchoscopie. Ces dernières années, nous avons développé un système de microspectro-imagerie confocale fibrée permettant l’obtention, in vivo, in situ, d’une image et d’un spectre d’autofluorescence pour la même zone tissulaire [1]. À l’aide de ce dispositif, nous avons étudié in vivo la microstructure de l’arbre bronchique, des bronches proximales jusqu’aux alvéoles. Nous avons ainsi montré que l’utilisation d’une excitation de longueur d’onde 488 nm permettait de visualiser spécifiquement la structure élastique sous-épithéliale des parois bronchique et alvéolaire et de suivre l’altération du réseau d’élastine lors de différentes pathologies [2], [3]. La limitation de cette technique vient de son incapacité à visualiser le collagène, qui constitue, avec l’élastine, une des principales protéines de la matrice extracellulaire (MEC) des tissus conjonctifs.
Le transfert des techniques de microscopie multiphotonique en endomicroscopie ouvrirait un champ nouveau au diagnostic endoscopique. En combinant différents modes de contraste telles que la fluorescence excitée à deux photons (2PEF) et la génération de seconde harmonique (SHG), il serait notamment possible de visualiser simultanément les fibres d’élastine (par 2PEF) et de collagène (par SHG) de la MEC. Sachant que plusieurs pathologies majeures telles que le cancer ou les pathologies infiltrantes du poumon profond sont caractérisées par des modifications précoces du réseau fibré d’élastine et de collagène de la MEC, la micro-endoscopie multiphotonique constituerait une avancée majeure en imagerie diagnostique, avec d’importantes retombées en clinique humaine.
De plus, l’utilisation d’impulsions infrarouges permet de limiter les problèmes de diffusion optique des tissus, qui est particulièrement forte dans le spectre visible, et à terme de pouvoir observer le tissu plus en profondeur [4].
L’objectif du projet InVivo-ONL est de développer, à partir de la technologie originale de microscopie confocale fibrée, mise au point par Mauna Kea Technologies, un endomicroscope permettant d’effectuer de l’imagerie multiphotonique in vivo, in situ, qui sera utilisée en première intention pour l’étude de la MEC in vivo du tissu pulmonaire, bronchique et alvéolaire. Ce projet pluridisciplinaire regroupe deux laboratoires de recherche, ANBioPhy et XLIM, une entreprise, Mauna Kea Technologies et le département de pneumologie du CHU de Rouen.
Section snippets
Déport d’impulsions femtosecondes par fibre optique endoscopique
La 2PEF de l’élastine et la SHG du collagène de la MEC pulmonaire sont des modes de contraste accessibles uniquement grâce à l’emploi d’impulsions infrarouges excitatrices ultra-courtes (durée < 100 fs) et intenses (puissance crête > 1 kW crête) mais faiblement énergétiques pour ne pas dégrader les tissus (énergie < 100 pJ). Pour réaliser ces imageries in vivo, in situ, il faut une fibre optique endoscopique (e.g. le guide d’image multicœur qui équipe l’endomicroscope de Mauna Kea Technologies) capable
Accordabilité
L’accordabilité en longueur d’onde du système de précompensation a été vérifiée. De 790 à 900 nm, la ligne de grism a permis d’obtenir des impulsions de largeur temporelle autour de 70 fs en sortie de la fibre optique de 2 m de longueur [7]. En sortie du guide d’image Fujikura, les durées temporelles ont été évaluées à 96 ± 13 fs, l’écart-type étant justifié par les différences paramétriques (biréfringence, diamètre, etc.) pouvant exister entre différents cœurs de fibre.
Pour des impulsions
Spectroscopie et endospectroscopie de tissus pulmonaires
Deux types de tissu pulmonaire humain sain ont été utilisés dans cette étude, l’un provenant d’une bronche proximale et l’autre d’un territoire alvéolaire. Ces échantillons, préparés par le CHU de Rouen, ont été prélevés sur un échantillon de lobectomie, loin de la zone tumorale, et fixés dans une solution de paraformaldehyde à 4 %. Après fixation, les tissus ont été coupés en tranches d’environ 1 mm d’épaisseur qui sont placés sur une lame de microscope pour les mesures spectroscopiques.
Deux
Imagerie par endoscopie
Le schéma d’endospectroscopie a été modifié afin de permettre l’enregistrement d’image (Fig. 4). La fibre sonde est remplacée par le guide d’images Fujikura (10 000 cœurs) de 2 m de long et une lentille GRIN est fixée à la partie distale afin de focaliser le faisceau sur l’échantillon. Un système de balayage Mauna Kea Technologies (constitué d’un miroir résonant et d’un miroir galvanométrique) permet l’injection du faisceau cœur par cœur successivement. Le spectromètre est remplacé par un tube
Système multimodal
Actuellement, nous abordons le développement d’une version du dispositif que l’on peut qualifier de « multimodale » puisque sa fonction est de rendre possible l’affichage des deux modalités d’imagerie SHG et 2PEF simultanément en temps réel sans modification séquentielle des filtres au niveau du système de détection. L’endomicroscope non linéaire dans sa configuration multimodale (Fig. 6) comprend alors les éléments spécifiques suivants :
- •
un oscillateur femtoseconde de type MICRA (COHERENT) à
Conclusion
Grâce à la mise au point d’un étireur à grism unimodal nous permettant de précompenser la dispersion de la fibre optique, nous avons pu développer un endospectroscope non linéaire accordable en longueur d’onde d’excitation.
Les résultats obtenus sur des échantillons de tissu pulmonaire ont rendu possible l’identification d’une bande spectrale d’excitation pour laquelle les émissions 2PEF de l’élastine et SHG du collagène sont présentes, alors que l’émission 2PEF du collagène a disparu,
Déclaration d’intérêts
Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.
Remerciements
Les auteurs remercient l’Agence nationale de la recherche pour le financement du projet : InVivo-ONL ANR-08-TECS-0006-01.
Références (7)
- et al.
Fibered confocal spectroscopy and multicolor imaging system for in vivo fluorescence analysis
Opt Express
(2007) - et al.
In vivo imaging of the bronchial wall microstructure using fibered confocal fluorescence microscopy
Am J Respir Crit Care
(2007) - et al.
Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy
Eur Respir J
(2009)
Cited by (2)
Catheter-based optical approaches for cardiovascular medicine: Progress, challenges and new directions
2020, Progress in Biomedical EngineeringMulticolor probe-based confocal laser endomicroscopy: A new world for in vivo and real-time cellular imaging
2013, Progress in Biomedical Optics and Imaging - Proceedings of SPIE